Booster ru: Производство промышленных паровых котлов BOOSTER

Автор: | 03.11.1978

Содержание

Собчак порекомендовали обратиться в полицию из-за возможной слежки за ней

Ксения Собчак сообщила в пятницу, 15 октября, сотрудникам Росгвардии, что за ней предположительно следят неизвестные на машине. В ведомстве, как указал его официальный представитель Валерий Грибакин, посоветовали телеведущей написать заявление в органы внутренних дел.

«Действительно, Ксения Анатольевна была сегодня в одном из зданий Росгвардии. Она обращалась с вопросом, что за ней якобы ведется слежка неизвестными лицами на машине. В связи с этим ей было рекомендовано действовать в соответствии с законодательством, если есть все причины, то написать официальное заявление в органы внутренних дел», — приводит его слова ТАСС.

Информация о том, что за Собчак

началась слежка после резонансного ДТП в Краснодарском крае, ранее появилась в соцсетях.

«Почти все так, только речь не только о слежке, а о прямых и очень жестких угрозах мне и моей семье», — прокомментировала ситуацию сама Собчак в своем Telegram-канале «Кровавая барыня». По мнению ряда наблюдателей, после аварии, в которой погиб человек, телеведущей следовало бы его переименовать.

Напомним, вечером 9 октября на трассе под Адлером при обгоне водитель представительского Mercedes-Maybach, в котором находилась направлявшаяся в аэропорт Сочи телеведущая, выехал на полосу встречного движения. Он столкнулся с автомобилем Volkswagen, который затем задел рейсовый микроавтобус. В результате ДТП погибла пассажирка Volkswagen Екатерина Тарасова, водитель и вторая пассажирка оказались в больнице. Пассажиры микроавтобуса не пострадали.

Позднее водитель Mercedes-Maybach Олег Цой признал вину в нарушении правил дорожного движения, он находится под домашним арестом. По словам Собчак, она находилась на заднем пассажирском сиденье и общалась по Zoom со своей командой, не следя за дорогой и действиями водителя — на рейс до Москвы она успевала и водителя не торопила.

«Очень наглый маневр»

13 октября была опубликована запись момента аварии с видеорегистраторов и камер, установленных в микроавтобусе. На ней видно, что в момент ДТП Mercedes-Maybach обгонял попутный автобус. «Кадры свидетельствуют, что водитель Maybach «совершал очень наглый маневр, который граничит с самоубийством», потому что он обгонял автобус, выехав на встречную полосу – и это было на дороге, которая имеет по одной полосе для движения в каждую сторону», — прокомментировал

«Газете.Ru» эту запись адвокат автомобильного движения «Свобода выбора» Сергей Радько.

«Водитель этого автомобиля совершил роковую ошибку, попав в ситуацию, в которой бывали многие водители со стажем – когда ты обгоняешь ночью, по свету фар очень сложно определить расстояние до встречного автомобиля. Выезжая столь уверенно на полосу встречного движения, водитель Maybach совершил грубейшее нарушение ПДД, а кроме того, неверно оценил расстояние до встречной машины», — отметил координатор сообщества «Синие ведерки» Петр Шкуматов.

Как стало известно ранее, Ксению Собчак вызвали на очную ставку с водителем Олегом Цоем, но она не смогла явиться в следственное управление сочинского УВД «из-за плохого состояния здоровья». Следственное действие перенесли на следующую неделю.

При этом Собчак дала свидетельские показания по этому уголовному делу в ГСУ МВД России.

первый в России акселератор технологических стартапов в области экологии

Пармон Валентин Николаевич

Доктор химических наук, профессор, академик РАН, председатель Сибирского отделения РАН. Лауреат Государственной премии России (2009). Член Консультативного научного совета Фонда «Сколково»

Яковлев Вадим Анатольевич

д.х.н., заместитель директора Института катализа СО РАН по научной работе

Мажуга Александр Георгиевич

Д.х.н, профессор РАН, Ректор РХТУ им. Д.И. Менделеева

Кокорин Алексей Олегович

Директор программы «Климат и энергетика» WWF

Нагибин Андрей Николаевич

Председатель Правления, исполнительный директор Общероссийской общественной организации «Зелёный патруль»

Антон Константинович Козлов

Директор проектов направления «Новый бизнес», АНО «Агентство стратегических инициатив по продвижению новых проектов»

Коробов Андрей Владимирович

Генеральный директор ЯТЭК

Кузнецов Сергей Петрович

Заместитель генерального директора по добыче и переработке ЯТЭК

Черепанов Александр Александрович

Технический директор ЯТЭК

Ежов Александр Владимирович

Начальник планово-производственного управления

Ирина Мусина

Руководитель практики устойчивого развития Accenture в России и Казахстане

Жамиля Каменева

Директор по развитию и инновационным партнерам, Accenture в России и Казахстане

Филипп Мухин

Руководитель практики Открытые инновации, Accenture в России и Казахстане

Бутко Александр Александрович

Управляющий директор ПАО «Моэснерго»

Петелин Сергей Александрович

Заместитель директора по производству ООО «Газпром энергохолдинг»

Ленев Сергей Николаевич

Заместитель управляющего директора — главный инженер ПАО «Мосэнерго»

Вивчар Антон Николаевич

Начальник инженерного управления ПАО «Мосэнерго»

Байкалов Вячеслав Николаевич

Генеральный директор ООО «Алмаз Удобрения»

Сигитов Олег Юрьевич

Руководитель проектов Службы экспертизы и технического развития ПАО «Мосэнерго»

Битней Владислав Дмитриевич

Специалист Службы экспертизы и технического развития ПАО «Мосэнерго»

Третьяк Наталья Владимировна

Первый Вице-Президент «Газпромбанка»

Панов Роман Сергеевич

Первый Вице-Президент «Газпромбанка»

Шулаков Денис Владимирович

Первый Вице-Президент «Газпромбанка»

Петрухин Андрей Николаевич

Начальник управления инновационного развития Департамента стратегии и инноваций ПАО «Газпром нефть»

Муслимов Руслан Фаритович

Начальник управления охраны окружающей среды Департамента по внедрению системы управления операционной деятельностью и производственной безопасности (БРД) ПАО «Газпром нефть»

Скрипник Ирина Васильевна

Руководитель направления экологии производства и экологической безопасности, блок логистики, переработки и сбыта «Газпром нефти»

Гаврилов Николай Александрович

Руководитель направления, департамент стратегии и инноваций «Газпром нефти»

Чикалов Сергей Геннадьевич

Заместитель Генерального директора по научно-техническому развитию и техническим продажам ООО «НТЦ ТМК»

Пышминцев Игорь Юрьевич

Генеральный директор ООО «НТЦ ТМК», Генеральный директор ОАО «РосНИТИ»

Михайлова Елена Николаевна

Начальник УЭПЭ — главный эколог ПАО «ТМК»

Крашенинин Евгений Юрьевич

Заместитель генерального директора «Хеликс»

Дюбо Данил Юрьевич

Инженер-эколог «Хеликс»

Арно Ле Фолль

Глава, Концерн «Тоталь» в России; генеральный директор, «Тоталь Разведка Разработка Россия»

Писаренко Дмитрий Владиленович

Вице-президент по исследованиям и инновациям, Total

Селезнёв Станислав Сергеевич

Вице-президент по экологии и промышленной безопасности «Норникеля»

Бусько Виталий Геннадьевич

Вице-президент по инновациям «Норникеля»

Кустарин Игорь Игоревич

Директор Центра инновационного развития «Норникеля»

Клейман Александр Анатольевич

Начальник управления экологической экспертизы, департамент экологии «Норникеля»

Клепиков Игорь Викторович

Главный менеджер, управление экологической экспертизы, департамент экологии «Норникеля»

Лаптев Андрей Александрович

Директор по развитию бизнеса и корпоративным венчурным проектам АО «Северсталь»

Горбачев Дмитрий Николаевич

Директор по развитию бизнес-системы АО «Северсталь Менеджмент»

Калашникова Ольга Валерьевна

Начальник управления экологии ПАО «Северсталь»

Белов Михаил Николаевич

Главный эколог ПАО «Северсталь»

Ефремова Рената Ольгертовна

Менеджер (по организации водоохранной деятельности) ПАО «Северсталь»

Литвинов Владимир Игоревич

Менеджер (по организации воздухоохранной деятельности) ПАО «Северсталь»

Сухова Светлана Николаевна

Менеджер (по организации деятельности по обращению с отходами) ПАО «Северсталь»

Грачев Андрей Владимирович

Руководитель направления Корпоративный НИОКР ООО «СИБУР»

Гайнуллин Анас Агтасович

Директор функции Охрана труда и промышленная безопасность ПАО «СИБУР Холдинг»

Маслова Ольга Владимировна

Старший менеджер по инновациям ПАО «Энел Россия»

Лоран Паганон

Глава Представительства компании «Электрисите де Франс»

Валери Прюнье

Директор по открытым инновациям Electricité de France

Ксения Сырцева

Специалист по инновациям Electricité de France

Анна Шаравьева

Старший менеджер по развитию бизнеса Electricité de France

Дружина Вадим

Старший Вице-президент по стратегическому развитию и управлению продукцией Группы Илим

Коваленко Марина

Руководитель программы «Илим Инновация»

Марущак Никита

Главный специалист дирекции по продуктовым и технологическим инновациям Группы Илим

Крючков Виталий Геннадьевич

Генеральный директор НИЦ «Строительство»

Лейбман Михаил Евгеньевич

Директор по научно-техническим проектам и экспертизе НИЦ «Строительство»

Акимов Павел Алексеевич

ректор НИУ МГСУ, академик Российской академии архитектуры и строительных наук (РААСН), профессор, доктор технических наук, Лауреат Премии Правительства Российской Федерации в области науки и техники для молодых ученых

Карасевич Владислав Александрович

к.т.н., доцент кафедры (базовой) возобновляемых источников энергии, РГУ нефти и газа (НИУ) имени И.М. Губкина

Stream Booster — бесплатное продвижение Twitch-каналов

Stream Booster — это бесплатный сервис продвижения стримеров на самой популярной на сегодняшний день платформе онлайн-трансляций Twitch.tv. Система устроена таким образом, что начинающие стримеры помогают друг другу найти новых зрителей по всему миру и тем самым продвинуть свою трансляцию естественным путем. Благодаря системе Stream Booster продвижение Twitch-канала осуществляется бесплатно, абсолютно безопасно и не требует особых временных затрат. Если вы решили заняться продвижением своего канала на Твиче и получить новых постоянных зрителей ваших будущих трансляций, то Stream Booster — именно то, что вам в этом поможет.

Почему накрутка ботов на Twitch неэффективна

Накрутка ботов на первый взгляд может показаться самым простым и действенным способом продвижения в Twitch. Однако, мы крайне не рекомендуем вам использовать этот метод раскрутки своего канала по ряду причин.

Во-первых, это не бесплатно. Использование сервисов по накрутке ботов довольно дорого обходится и очень ненадежно, а часть ботов вообще не учитывается в качестве зрителей канала и авторизованных пользователей чата трансляции.

Во-вторых, боты не создают никакой активности в чате, а ведь это главный показатель качества контента, который предоставляет стример своим зрителям. Ни для кого не секрет, что существует прямая и очевидная зависимость — чем интереснее трансляция, тем выше активность зрителей в чате. Используя сервисы по накрутке ботов, вы лишь искусственно увеличиваете число «зрителей» своей трансляции, но при этом взамен не получаете практически ничего.

Продвижение Twitch-канала реальными зрителями

Все начинающие стримеры рано или поздно задаются одним и тем же вопросом — «где взять зрителей на свой Twitch-канал?«. Этот вопрос возникает сразу после запуска первой трансляции, на которой, как показывает практика, обычно нет ни одного зрителя. Дело в том, что трансляции, не пользующиеся популярностью, располагаются в самом низу рейтинга Twitch.tv, а значит шанс, что на них зайдут реальные зрители крайне мал.

Как только трансляцию начинают смотреть, ее позиция в рейтинге повышается и она становится более заметной на самом сайте или в приложении Twitch. Благодаря этому вы получаете новых зрителей, а если стрим достаточно интересный, то и подписчиков, которые в будущем могут стать вашими постоянными зрителями. Таким образом, продвижение осуществляется благодаря так называемому эффекту «снежного кома», для которого необходимо задать начальное ускорение.

Система Stream Booster создана для выполнения данной задачи и довольно эффективно с ней справляется на протяжении нескольких лет. Результатом работы системы является успешное продвижение большинства пользователей, которые получают ощутимый приток реальных зрителей и подписчиков в Twitch.

Влияние качества контента на популярность канала на Twitch.tv

Популярность канала на Twitch.tv зависит от многих факторов — регулярность и качество трансляций, степень вовлеченности зрителей, навыки игры и общения со зрителями, количество подписчиков, корректность настроек трансляции, актуальность и востребованность контента, наличие веб-камеры, стабильность подключения к интернету, мощность компьютера и др.

Несмотря на то, что параметров, влияющих на популярность трансляции очень много, отдельным пунктом стоит выделить именно качество контента, предоставляемого зрителям Twitch.tv. Не столь важно, как красиво будет оформлен и хорошо настроен ваш стрим и насколько мощную видеокарту вы купили для современных игр, ведь если вы совсем не умеете играть и не общаетесь со своими зрителями, то популярность вашего канала на Твиче расти не будет.

Постарайтесь дать зрителям то, в надежде на что они к вам пришли — веселое времяпровождение, качественный и интересный контент, а также кучу всевозможных эмоций от просмотра трансляции.

Как раскрутить канал на Twitch.tv в системе Stream Booster

Система Stream Booster настолько проста и интуитивно понятна пользователям, что раскрутить свой канал смогут любые желающие. Все, что вам нужно сделать — это авторизоваться одним кликом, используя существующую учетную запись на Twitch.tv, выбрать удобное время продвижения трансляции и занять соответствующее место в таблице продвижения.

Новые зрители сами придут к вам, как только очередь дойдет до вашего канала, а будут ли они активны в чате и вернутся ли снова — зависит только от вас. Stream Booster помогает стримерам найти новых зрителей, а зрителям — интересные трансляции и качественный контент для общения и приятного времяпровождения с единомышленниками.

Раскрутка Twitch-канала станет еще более интересным и увлекательным занятием, благодаря множеству приятных бонусов, предусмотренных для пользователей системы Stream Booster.

Booster Lift + (Укрепляющий концентрат LIFT +)

Если вы еще не открыли для себя бустеры Yon-Ka, вы многое теряете. Зачем? Эти концентраты (бустеры) позволяют легко настроить уход за кожей в соответствии с конкретными потребностями вашей кожи.

В некоторые месяцы вам может потребоваться больше увлажнения, чем в другие (например зимой), а иногда стресс или недостаток сна могут сделать вашу кожу тусклой. Вместо того, чтобы менять увлажняющий крем в соответствии с потребностями вашей кожи, бустеры Yon-Ka позволяют улучшить текущий уход за кожей всего несколькими дополнительными каплями.

В то время как некоторые из бустеров предназначены для определенных состояний кожи или разных времен года, бустер Lift + можно использовать для любого типа кожи и в любое время года.

Признаки старения могут проявиться уже к двадцати годам, и этот простой в использовании препарат делает очень удобным добавление антивозрастных свойств к повседневному уходу за кожей. Этот легкий концентрат на водной основе подтягивает кожу, помогая изменить форму вашего лица и шеи. Он имеет нежирную текстуру, которая подходит для всех типов кожи и легко сочетается как с утренними, так и с дневными кремами.

Продолжайте читать, чтобы узнать больше об ингредиентах бустера Lift + и о том, как этот препарат обеспечивает гладкость и молодость вашей коже…

Бустер Lift + содержит растительные компоненты, которые подтягивают и укрепляют кожу

Укрепляющий концентрат Lift + не содержит парабенов и состоит из большинства натуральных ингредиентов. Внутри вы найдете 20 экстрактов растений, которые обладают уникальными преимуществами для кожи.

  • Один из его ключевых ингредиентов — розмарин, который содержится в квинтэссенции Yon-Ka. Его цель в бустере Lift + — бороться с преждевременным старением. Это связано с тем, что розмарин повышает эластичность кожи, уменьшает количество солнечных пятен и даже защищает от солнечных лучей в будущем. Он также обладает антисептическими свойствами, которые тонизируют и подтягивают цвет лица.
  • Еще один звездный ингредиент, который вы можете обнаружить в бустере Lift + — это хмель. Да, из того же сырья, что и для пива. В уходе за кожей экстракт хмеля можно использовать для лечения сухости и подтяжки кожи.
  • Бустер Lift + также содержит шалфей, известный своими регенерирующими свойствами. Шалфей увеличивает коллаген в клетках кожи и обновляет их. Эффект — более упругая кожа и более ровный тон — достаточная причина для включения шалфея в этот концентрат.

Легко добавляйте

Lift + к своему уходу за кожей

Включить бустер Lift + в повседневный уход за кожей очень просто. После очищения и тонизирования просто смешайте одну-две порции бустера с вашим любимым увлажняющим кремом Yon-Ka и нанесите на лицо и шею. Вы можете использовать бустер Lift + всякий раз, когда хотите оживить стареющую кожу.

Комбинируйте бустер Lift + с другими бустерами Yon-Ka (Nutri +, Hydra + и Defense +) для получения поистине индивидуального ухода за кожей.

Amazon.com: Weiss Schwarz Booster Pack To LOVE Ru — проблема


Цена: 732 доллара.90 + $ 49,80 перевозки
  • Убедитесь, что это подходит введя номер вашей модели.
  • Мы отправим товар из Токио, Япония.
  • Доставка товара займет от 7 до 14 рабочих дней с момента оплаты.
  • (C) Кентаро Ябуки, Шаки Хасеями / Шуэйша? Raku Darkness Production Committee (C) bushiroad Все права защищены.

Ампулы для депигментации Sesderma Azelac Ru 10×1.5 мл

Магазин по BRANDSA-CerumenA-DermaACM LaboratoireadidasAkileineAPIVITAATLAustralian GoldAveenoAvèneAzzaroB.U.BabéBAIOBAYBeauty BlenderBella AuroraBentonBenzacareBepanthenBio-OilBiodermaBiofreezebiotenBiretixBoí ThermalBoucheronBritney SpearsBuccothermBurberryCacharelCaladrylCalvin KleinCare к BeautyCarmexCarolina HerreraCatriceCaudalieCellulaseCentrumCeraVeCetaphilCHANELChloéCicamelCistitone ClarinsCliniqueCoachCollistarComodynesCompeedCOSRXCystiphaneDarphinDavidoffDEPOT — The Male ToolsDiadermineDieselDiorDR GRANDELDr.Ботаника HauschkaDr. SchollDsquared2 DucrayEcookingEcophaneEcrinalElancylElizabeth ArdenEllacareEmbryolisseEndocareEnnaErborianEscadaessenceessieEstée LauderEsthedermEtat PurEucerinEvolve Органические BeautyFadiamoneFilorgaFlormarFoamieFolstimFOREOFrezydermG9 SkinGalénicGallinéeGarnierGilletteGlovGucciHalibutHalloween HeliocareHello SundayHidroHolika HolikaHugo BossInteaInvisibobbleISDINIvy BearsJean Пол GaultierJimmy ChooJowaéJuicy CoutureKloraneKolestonKPLL’Oréal ParisL’Oréal ProfessionnelLa PrairieLa Roche-PosayLacosteLactacydLancasterLanvinLastObjectLazartigueLETILibenarLieracLutsineMádaraMarc JacobsMarimerMario BadescuMartidermMavalaMaybellineMedelaMesoesteticMIMITIKAMisshaMissoniMizonMontblancMoschinoMoustidoseMustelaNeoretinNeoStrataNeutrogenaNina RicciNioxinNiveaNorevaNourkrinNovidermNUXENYX Professional MakeupOenobiolOhropaxOld SpiceOPIOral-BOwowPaco RabanneParfums GrèsPestle & MortarPhysiodosePhytoPierre Fabre DermatologiePiz BuinPurelogicolRalph LaurenReal TechniquesRedkenRemescarRené FurtererRetinc areReuzelRevlonRhinomerRilastilRimmel LondonRoCRochasRoger & GalletRosacureШварцкопфTONYMOLYToo Cool For SchoolTopicremTousUriageVersaceVichyViviscalWeledaWellaYOUTH LAB

Sesderma azelac ru бустер для депигментации в ампулах 10×1,5 мл

Описание

Sesderma Azelac Ru Depigmenting Booster Ampoules для эффективного предотвращения и уменьшения темных пятен…

Sesderma Azelac Ru Depigmenting Booster Ampoules объединяет концентрированные ингредиенты, которые помогают эффективно предотвращать и уменьшать гиперпигментацию . Они созданы для ухода за кожей с гиперпигментацией.По этой причине они предлагают два варианта лечения одним продуктом:

  • Интенсивная шоковая терапия: в этом случае наносите по 1 ампуле в день на все лицо в течение 5-10 дней подряд. На каждую ампулу можно наносить 2 раза, поэтому следует наносить половину ампулы утром и половину на ночь легкими круговыми массирующими движениями. В этот период интенсивного лечения эти ампулы используются для замены сыворотки.
  • Поддерживающая процедура : после завершения процедуры против пигментных пятен и для предотвращения появления, для сохранения достигнутых результатов, наносите одну ампулу в неделю, в идеале после отшелушивания кожи.Это обеспечивает постоянное подавление перепроизводства меланина.

Следовательно, ампулы показаны для шокового лечения гиперпигментаций различного происхождения, таких как меланодермия или поствоспалительные гиперпигментации. Подходит для всех типов кожи и всех фототипов.

Ключевые ингредиенты

В формулу ампул

Azelac Ru входят депигментирующие ингредиенты. В частности, азелаиновая кислота, 4-бутилрезорцин, транексамовая кислота, витамин С и ретиналь — все липосомы.И все же факторы роста (HGH), экстракт Morus alba, глицирретиновая кислота, диацетилболдин, ундециленилфенилаланин и ниацинамид. Таким образом, комбинация этих ингредиентов позволяет динамически лечить гиперпигментации, действуя с разными механизмами действия:

  • — ингибирование фермента тирозиназы;
  • — блок эндотелина I;
  • — ингибирование превращения плазминогена в плазмин;
  • — ингибирование МСГ;
  • — контроль гиперактивности меланоцитов;
  • — эффект обновления кожи.

Таким образом, возможно мультифокусное действие. Кроме того, благодаря нанотехнологиям активы достигают целевых клеток (меланоцитов) в отличных концентрациях. В результате достигается максимальная эффективность в сочетании с отличной переносимостью.

Процедура красоты

Очистите лицо очищающим гелем Sesderma Hidraderm TRX Cleansing Gel, подходящим для кожи с прыщами. Затем нанесите тоник той же линии, Hidraderm TRX Tonic. Два продукта, которые помогут удалить с кожи всю грязь, а также улучшат проникновение интенсивных средств против пятен.

Затем нанесите ампулу Sesderma Azelac Ru. Ампулу можно использовать одним из следующих способов:

  • Интенсивная шоковая терапия: в этом случае наносите по 1 ампуле в день на все лицо в течение 5-10 дней подряд. На каждую ампулу можно наносить 2 раза, поэтому следует наносить половину ампулы утром и половину на ночь легкими круговыми массирующими движениями. В этот период интенсивного лечения эти ампулы используются для замены сыворотки.
  • Поддерживающая процедура : после завершения процедуры против пигментных пятен и для предотвращения появления, для сохранения достигнутых результатов, наносите одну ампулу в неделю, в идеале после отшелушивания кожи.Это обеспечивает постоянное подавление перепроизводства меланина.

Выбрав любой из возможных вариантов лечения, массируя ампулу на лицо, нанесите увлажняющий крем. Мы предлагаем утром нанести Azelac Ru SPF50 Fluid Luminous, который обеспечивает защиту от солнца и депигментирующее действие. А на ночь — Azelac Ru Gel-Creme Depigmenting.

По окончании интенсивной шоковой терапии ампулы следует заменить на Azelac Ru Sérum Liposomal.

Что мы знаем о прививках от COVID-19?

U.Чиновники здравоохранения США могут вскоре порекомендовать вакцинацию против COVID-19 полностью вакцинированным американцам. Посмотрите, что мы знаем о бустерах и о том, как они могут помочь в борьбе с коронавирусом:

ЗАЧЕМ НАМ МОГУТ НУЖНЫ БУСТЕРЫ?

Защита от вакцин обычно со временем снижается. Например, ревакцинация от столбняка рекомендуется каждые 10 лет.

Исследователи и представители здравоохранения отслеживают реальную эффективность вакцин против COVID-19, чтобы узнать, как долго длится защита вакцинированных людей.Вакцины, разрешенные в США, по-прежнему обеспечивают очень надежную защиту от тяжелых заболеваний и смерти.

Но лабораторные анализы крови показали, что антитела — один из уровней защиты иммунной системы — со временем могут ослабевать. Это не означает, что защита исчезает, но это может означать, что защита не такая сильная или что организму может потребоваться больше времени, чтобы сопротивляться инфекции.

Дельта-вариант усложнил вопрос о том, когда давать бустеры, потому что он намного более заразен, и большая часть данных, собранных об эффективности вакцины, относится к тому времени, когда дельта-вариант получил широкое распространение.Дельта набирает обороты одновременно с тем, что иммунитет к вакцинам может снижаться и у первых вакцинированных людей.

Израиль предлагает ревакцинацию людям старше 50 лет, которые были вакцинированы более пяти месяцев назад. Франция и Германия планируют предложить некоторым людям бустеры осенью. Европейское агентство по лекарственным средствам заявило, что оно также изучает данные, чтобы узнать, нужны ли ревакцинации.

КОГДА ОНИ БУДУТ ОТДАВАТЬ?

Это зависит от того, когда вы сделали первые выстрелы. Одна из возможностей заключается в том, что чиновники здравоохранения порекомендуют людям сделать ревакцинацию примерно через восемь месяцев после второй прививки вакцины Pfizer или Moderna.

Должностные лица продолжают сбор информации об одноразовой вакцине Johnson & Johnson, которая была разрешена для использования в США в конце февраля, чтобы определить, когда рекомендовать бустеры.

КТО ИХ ПОЛУЧИТ?

Первые люди, вакцинированные в США, скорее всего, будут первыми в очереди на ревакцинацию. Это означает, что медицинские работники, жители домов престарелых и другие пожилые американцы были первыми, кто был вакцинирован после того, как прививки были разрешены в декабре прошлого года.

БУСТЕР? ТРЕТИЙ КАДР? КАКАЯ РАЗНИЦА?

Реципиенты трансплантата и другие люди с ослабленной иммунной системой, возможно, изначально не получили достаточной защиты от вакцин. Теперь они могут получить третью дозу по крайней мере через 28 дней после второй прививки в рамках первоначальной серии прививок, необходимой для полной вакцинации. Тем, у кого нормальная иммунная система, бустеры вводятся намного позже после полной вакцинации — не для установления защиты, а для ее повторного усиления.

КАКИЕ ВОПРОСЫ ОСТАЮТСЯ?

До сих пор неизвестно, должны ли люди делать прививки того же типа, что и при первой вакцинации. И ведущие советники по вопросам здравоохранения страны будут искать доказательства безопасности бустеров и того, насколько хорошо они защищают от инфекций и тяжелых заболеваний.

Глобальный доступ к вакцинам также важен для сдерживания пандемии и предотвращения появления новых вариантов. Ракетные инъекции могут ограничить и без того ограниченные глобальные поставки вакцины.

А что насчет непривитых?

Др.Мелани Свифт, которая возглавляла программу вакцинации в клинике Мэйо в Рочестере, штат Миннесота, говорит, что введение большего количества прививок людям, которые еще не были вакцинированы, является «нашим лучшим инструментом не только для предотвращения госпитализации и смертности от дельта-варианта. , но чтобы остановить передачу «. По ее словам, каждая инфекция «дает вирусу больше шансов мутировать, неизвестно, каким может быть следующий вариант».

«Люди, впервые получившие вакцину, скорее всего, выстроятся в очередь и получат ревакцинацию», — говорит Свифт.«Но в целом мы не достигнем наших целей, если все их непривитые соседи не будут вакцинированы».

___

Департамент здравоохранения и науки Ассошиэйтед Пресс получает поддержку от Департамента естественнонаучного образования Медицинского института Говарда Хьюза. AP несет полную ответственность за весь контент.

Минут ракетного ускорителя — прошлые годы

Выбор Значок типа файла Имя файла Описание Размер Версия Время Пользователь
Выбор Значок типа файла Имя файла Описание Размер Версия Время Пользователь
Ċ 2010.1 Booster Minutes 5-5.pdf
Просмотр Скачать
565k версия 2 14 янв.2014 г., 18:00 [email protected]
Ċ 2010.2 Booster Minutes 5-15.pdf
Просмотр Скачать
321к версия 2 14 янв.2014 г., 18:00 [email protected]
Ċ 2010.3 Booster Minutes 7-20.pdf
Просмотр Скачать
338к версия 2 14 янв.2014 г., 18:00 [email protected]
Ċ 2010.4 Booster Minutes 8-10.pdf
Просмотр Скачать
528к версия 2 14 янв.2014 г., 18:00 [email protected]
Ċ 2010,5 Booster Minutes 10-13.pdf
Просмотр Скачать
563k v.2 14 янв.2014 г., 18:00 [email protected]
Ċ 2010.6 Booster Minutes 11-8.pdf
Просмотр Скачать
716k версия 2 14 янв.2014 г., 18:00 [email protected]
Ċ 2010.7 Booster Minutes 12-15.pdf
Просмотр Скачать
317к версия 2 14 янв.2014 г., 18:00 леви[email protected]
Выбор Значок типа файла Имя файла Описание Размер Версия Время Пользователь
Ċ 2011.1 Booster Minutes 2-9.pdf
Просмотр Скачать
404к версия 2 14 янв.2014 г., 18:00 [email protected]
Ċ 2011.2 Booster Minutes 3-17.pdf
Просмотр Скачать
454к версия 2 14 янв.2014 г., 18:00 [email protected]
Ċ 2011.3 Booster Minutes 5-4.pdf
Просмотр Скачать
466к версия 2 14 янв.2014 г., 18:00 [email protected]
Ċ 2011.4 Booster Минуты 6-21.pdf
Просмотр Скачать
версия 2 14 янв.2014 г., 18:00 [email protected]
Ċ 2011.5 Booster Minutes 7-20.pdf
Просмотр Скачать
328 КБ версия 2 14 янв.2014 г., 18:00 [email protected]
Ċ 2011.6 Booster Minutes 8-16.pdf
Просмотр Скачать
368к v.2 14 янв.2014 г., 18:00 [email protected]
Ċ 2011.7 Booster Minutes 9-14.pdf
Просмотр Скачать
292к версия 2 14 янв.2014 г., 18:00 [email protected]
Ċ 2011.8 Booster Minutes 10-15.pdf
Просмотр Скачать
363к версия 2 14 янв.2014 г., 18:00 леви[email protected]
Ċ 2011.9 Booster Minutes 11-16.pdf
Просмотр Скачать
296к версия 2 14 янв.2014 г., 18:00 [email protected]
Выбор Значок типа файла Имя файла Описание Размер Версия Время Пользователь
Ċ 2012.1 Booster Minutes 1-11.pdf
Просмотр Скачать
1028к версия 2 14 янв.2014 г., 18:01 [email protected]
Ċ 2012.2 Booster Minutes 2-7.pdf
Просмотр Скачать
282к версия 2 14 янв.2014 г., 18:01 [email protected]
Ċ 2012,3 Booster Minutes 8-1.pdf
Просмотр Скачать
325 КБ версия 2 14 янв.2014 г., 18:01 [email protected]
Ċ 2012.4 Booster Minutes 9-5.pdf
Просмотр Скачать
348к версия 2 14 янв.2014 г., 18:01 [email protected]
Ċ 2012,5 Booster Minutes 11-14.pdf
Просмотр Скачать
857к v.2 14 янв.2014 г., 18:01 [email protected]
Ċ 2012.6 Booster Minutes 12-12.pdf
Просмотр Скачать
225 КБ версия 2 14 янв.2014 г., 18:01 [email protected]
Выбор Значок типа файла Имя файла Описание Размер Версия Время Пользователь
Ċ 2013.1 Booster Minutes 1-9.pdf
Просмотр Скачать
538к версия 2 23 апреля 2014 г., 6:19 [email protected]
Ċ 2013.2 Booster Minutes 2-6.pdf
Просмотр Скачать
235к версия 2 23 апреля 2014 г., 6:19 [email protected]
Ċ 2013.3 Booster минут 5-8.pdf
Просмотр Скачать
533к версия 2 23 апреля 2014 г., 6:19 [email protected]
Ċ 2013.4 Booster Minutes 7-18.pdf
Просмотр Скачать
223к версия 2 23 апреля 2014 г., 6:19 [email protected]
Ċ 2013.5 Booster Minutes 8-14.pdf
Просмотр Скачать
301к v.2 23 апреля 2014 г., 6:19 [email protected]
Ċ 2013.6 Booster Minutes 9-11.pdf
Просмотр Скачать
296к версия 2 23 апреля 2014 г., 6:19 [email protected]
Ċ 2013.7 Booster Minutes 9-13.pdf
Просмотр Скачать
296к версия 2 23 апреля 2014 г., 6:19 леви[email protected]
Ċ 2013.8 Booster Minutes 10-9.pdf
Просмотр Скачать
310к версия 2 23 апреля 2014 г., 6:19 [email protected]
Ċ 2013.9 Booster Minutes 11-6.pdf
Просмотр Скачать
337к версия 2 23 апреля 2014 г., 6:19 [email protected]
Ċ 2013.9 Booster Minutes 12-11.pdf
Просмотр Скачать
296к версия 2 23 апреля 2014 г., 6:19 [email protected]
Выбор Значок типа файла Имя файла Описание Размер Версия Время Пользователь
Ċ 2014.a Booster Minutes 1-8.pdf
Просмотр Скачать
297к версия 2 7 апреля 2015 г., 10:13 [email protected]
Ċ 2014.b Booster Minutes 2-5.pdf
Просмотр Скачать
333 тыс. версия 2 7 апреля 2015 г., 10:13 [email protected]
Ċ 2014.c Booster Минуты 3-10.pdf
Просмотр Скачать
388к версия 2 7 апреля 2015 г., 10:13 [email protected]
Ċ 2014.d Booster Minutes 4-8.pdf
Просмотр Скачать
79к версия 2 7 апреля 2015 г., 10:13 [email protected]
Ċ 2014.e Booster Minutes 5-6.pdf
Просмотр Скачать
63к v.2 7 апреля 2015 г., 10:13 [email protected]
Ċ 2014.f Booster Minutes 6-10.pdf
Просмотр Скачать
402к версия 2 7 апреля 2015 г., 10:13 [email protected]
Ċ 2014.g Booster Minutes 8-6.pdf
Просмотр Скачать
407к версия 2 7 апреля 2015 г., 10:13 леви[email protected]
Ċ 2014.h Booster Minutes 9-3.pdf
Просмотр Скачать
405к версия 2 7 апреля 2015 г., 10:13 [email protected]
Ċ 2014.i Booster Minutes 10-8.pdf
Просмотр Скачать
313к версия 2 7 апреля 2015 г., 10:13 [email protected]
Ċ 2014.j Booster Minutes 11-3.pdf
Просмотр Скачать
387к версия 2 7 апреля 2015 г., 10:13 [email protected]
Ċ 2014.k Booster Minutes 12-3.pdf
Просмотр Скачать
305к версия 2 7 апреля 2015 г., 10:13 [email protected]

Первый мандат на прививку от COVID в штате Нью-Джерси

Больницы Нью-Джерси были одними из первых в Нью-Джерси, которые потребовали, чтобы все сотрудники прошли вакцинацию против COVID-19 в качестве условия приема на работу.

Они также первыми потребовали, чтобы сотрудники получили бустерную дозу вакцины COVID.

В июне университетская больница в Ньюарке первой посоветовала работникам сделать вакцину, иначе они могут потерять работу. Официальные лица больницы объявили, что любой, кто получил одноразовую вакцину Джонсона и Джонсона, должен пройти повторную вакцинацию, чтобы продолжать работать.

Ссылаясь на «убедительные доказательства» того, что прорывные инфекции растут среди медицинских работников, университетская больница установила крайний срок 24 декабря для тех, кто получил одну дозу вакцины J&J, чтобы получить ревакцинацию.

На данный момент этот мандат не распространяется на сотрудников, которым были сделаны прививки Pfizer или Moderna, но официальные лица больницы заявляют, что они «продолжат отслеживать данные, чтобы определить, потребуются ли какие-либо дополнительные санкции».

Что касается этого мандата, все сотрудники, получившие вакцину Johnson & Johnson в качестве первичной вакцинации, должны сделать ревакцинацию до пятницы, 24 декабря. У сотрудников будет возможность получить на свой выбор одну из трех одобренных вакцин против COVID-19, поскольку федеральное руководство допускает «сочетание и соответствие» инъекций первичной вакцинации и ревакцинации.Руководство больницы продолжит отслеживать данные, чтобы определить, потребуются ли какие-либо дополнительные полномочия для сотрудников, получивших вакцины Pfizer / BioNTech или Moderna. — Заявление / Университетская больница

Комиссар Департамента здравоохранения Нью-Джерси Джудит Персичилли цитируется в сообщении для печати больницы. «Медицинские работники непропорционально сильно пострадали от вируса COVID-19, — сказал Персичилли, — а при том, что вариант Delta остается активным, бустерные дозы помогут повысить иммунитет не только для реципиентов, но и в дальнейшем защитить медицинское сообщество.”

После того, как университетская больница объявила о своем мандате на вакцинацию сотрудников в начале этого года, другие больницы и больничные группы быстро последовали за ними и представили свои собственные. До сих пор две крупнейшие группы больниц Нью-Джерси, Hackensack Meridian и RWJ / Barnabas, не выпустили политику в отношении бустеров вакцинации.

Ответы на 25 распространенных вопросов о вакцинах против COVID-19

Вакцинация от COVID-19 началась в США 14 декабря 2020 года. Быстрое внедрение произошло чуть более чем через год после того, как вирус был впервые обнаружен в ноябре 2019 года. .Впечатляющая скорость, с которой были разработаны вакцины, также оставила у многих людей множество вопросов. Вопросы варьируются от практических (как мне сделать прививку?) До научных: как вообще действуют эти вакцины?

Продолжайте читать, чтобы узнать ответы на 25 распространенных вопросов о вакцине COVID-19.

Пункты досрочного голосования в каждом округе штата Нью-Джерси

В каждом округе штата будет от трех до 10 пунктов досрочного голосования, которые будут открыты ежедневно для всеобщих выборов 2021 года с октября.С 23 по 31 октября. Площадки будут открыты с 10 до 20 часов. кроме воскресенья, когда они закрываются в 18:00.

9 глупостей о Нью-Джерси

Иммунные ответы против вариантов SARS-CoV-2 после гетерологичной и гомологичной вакцинации ChAdOx1 nCoV-19 / BNT162b2

Участники

Участники этого анализа были из исследования CoCo (Немецкое клиническое испытание Registry, DRKS00021152), которое началось в марте 2020 года и представляет собой продолжающееся проспективное обсервационное исследование по мониторингу иммуноглобулина IgG к SARS-CoV-2 и иммунного ответа у 1493 медицинских работников в Ганноверской медицинской школе и у лиц с потенциальным контактом с SARS-CoV- 2 (исх. 18,22 ). Поправка от декабря 2020 года позволила нам изучить иммунный ответ после вакцинации от COVID-19. В соответствии с немецкими правилами, медицинские работники имели приоритет для вакцинации против SARS-CoV-2, а медицинские работники в Ганноверской медицинской школе получили первые дозы вакцины BNT после 6 января или вакцины ChAd после 16 февраля 2021 года. В целом бустерная вакцинация проводилась приблизительно 21 день после прайма BNT и 2–3 месяца после прайма ChAd. Бустерная вакцинация медицинских работников, примированных ChAd, началась 3 мая 2021 года, и люди могли выбрать получение ChAd или BNT для второй вакцинации.Мы предположили, что около 25% всех вакцинированных ChAd выберут гомологичную бустерную вакцину. Расчет мощности, выполненный с помощью G * Power (v3.1.9.6), показал, что размер выборки из 30 человек в каждой группе достаточен для выявления клинически значимых различий внутри каждой группы, при условии, что количество IgG, специфичных к белку, увеличивается вдвое по сравнению с первой вакцинацией. (среднее значение, 95 относительных единиц (RU) мл -1 , с SD 113 RU мл -1 ) и при использовании двустороннего парного теста t для различий между средними значениями с 95% степенью и уровень значимости 1%.Основываясь на приведенных выше расчетах и ​​ожидаемой частоте потерь для последующего наблюдения в 10%, 130 вакцинированных ChAd вакцинированных из когорты исследования CoCo были приглашены сдать кровь до начала их повторной вакцинации в начале мая 2021 года. Запись на прием для вакцинации координировалась независимая группа вакцинации в зависимости от наличия вакцины. После письменного информированного согласия мы взяли образцы периферической крови путем венепункции. В порядке очереди мы провели формальный статистический анализ после того, как не менее 30 человек в каждой группе получили повторную вакцинацию и прошли 13-й день после повторной вакцинации.Один человек с предыдущей инфекцией SARS-CoV-2, как определено с помощью положительных IgG к нуклеокапсиду против SARS-CoV-2 (NCP) перед вакцинацией, был исключен из этого анализа. Участники были 25% мужчин и 75% женщин, средний возраст 38 лет (диапазон 19–64 лет) и, таким образом, репрезентативны для всех вакцинированных в исследовании CoCo (72% женщин, 28% мужчин; средний возраст 40 лет, диапазон 19–67 лет). После сбора крови мы отделили плазму от крови с ЭДТА или литиевым гепарином (S-Monovette, Sarstedt) и хранили ее при -80 ° C до использования.Для стимуляции пулами пептидов SARS-CoV-2 мы использовали цельную кровь или мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) из образцов цельной крови, выделенных центрифугированием в градиенте фиколла.

pVNT

pVNT были выполнены в отделении биологии инфекций Немецкого центра приматов в Геттингене, как описано ранее 12 . Вкратце, рабдовирусные псевдотипные частицы были продуцированы в клетках 293T, трансфицированных для экспрессии желаемого варианта SARS-CoV-2-S, инокулированного VSV * DG-FLuc, вектором вируса везикулярного стоматита с дефицитом репликации (VSV), который кодирует усиленный зеленый флуоресцентный белок. и люцифераза светлячков (FLuc) вместо белка VSV-G (любезно предоставлена ​​Гертом Циммером, Институт вирусологии и иммунологии, Миттельхойзерн, Швейцария).Произведенные псевдочастицы собирали, очищали от клеточного дебриса центрифугированием и хранили при -80 ° C до использования. Для экспериментов по нейтрализации равные объемы псевдотипированных частиц и инактивированных нагреванием (56 ° C, 30 мин) образцов плазмы, серийно разведенных в культуральной среде, смешивали и инкубировали в течение 30 мин при 37 ° C. Впоследствии образцы вместе с псевдотипными частицами, не подвергавшимися воздействию плазмы, были использованы для экспериментов по трансдукции. Анализ проводили в 96-луночных планшетах, в которые клетки Vero инокулировали соответствующими смесями псевдотипированных частиц / плазмы.Эффективность трансдукции анализировали через 16-18 часов после инокуляции путем измерения активности FLuc в лизированных клетках (Cell Culture Lysis Reagent, Promega) с использованием коммерческого субстрата (Beetle-Juice, PJK) и люминометра для планшетов (Hidex Sense Microplate Reader, Hidex). с программным обеспечением Hidex Sense Microplate Reader (v0.5.41.0).

Серология

Мы определили серологию SARS-CoV-2 IgG с помощью количественного ELISA (анти-SARS-CoV-2 S1 домен спайкового белка / рецептор-связывающий домен (RBD) IgG SARS-CoV-2 QuantiVac, Euroimmun) в соответствии с инструкция производителя (разведение 1: 400 или 1: 600).Мы предоставляем уровни антител, выраженные как RU мл -1 , как оценивали по калибровочной кривой, со значениями выше 11 RU мл -1 , определенными как положительные. Мы выполнили измерения анти-SARS-CoV-2 S1 спайкового домена белка IgA или анти-SARS-CoV-2 NCP IgG в соответствии с инструкциями производителя (Euroimmun) и выразили количество антител в виде отношения IgA (оптическая плотность (OD), деленная на калибратор). Для анализа мы использовали AESKU.READER (AESKU.GROUP) и программное обеспечение Gen5 версии 2.01.

sVNT для вариантов SARS-CoV-2

Для определения нейтрализующих антител против уханьского шипа B.1.1.7-spike (Alpha), P.1-spike (B.1.1.28.1; Gamma) и B.1.351-spike (Beta) варианты SARS-CoV-2-S в плазме, мы недавно изменили нашу создан СВНТ 19 . В этом анализе растворимый рецептор SARS-CoV-2 — ангиотензинпревращающий фермент 2 (ACE2) — связывается с 96-луночными планшетами, с которыми различные очищенные меченые RBD белка-шипа SARS-CoV-2 могут связываться один раз. добавлен к пробе. Связывание дополнительно выявляется антителом, меченным пероксидазой, и колориметрическим количественным определением.Предварительная инкубация белка спайка с сывороткой или плазмой выздоравливающих пациентов или вакцинированных предотвращает последующее связывание с ACE2 в различной степени, в зависимости от количества присутствующих нейтрализующих антител. Более подробно, планшеты Maxisorp 96F (Nunc) были покрыты рекомбинантным растворимым белком hACE2-Fc (IgG1) из расчета 300 нг на лунку в 50 мкл буфера для покрытия (30 мМ Na 2 CO 3 , 70 мМ NaHCO 3 , pH 9,6) при 4 ° C в течение ночи. После блокирования с помощью hACE2-Fc (IgG1) планшеты промывали PBS, 0.05% Tween-20 (PBST) и блокировали разбавителем BD OptEIA Assay Diluent в течение 1,5 ч при 37 ° C. Тем временем образцы плазмы были серийно разбавлены в три раза, начиная с 1:20, а затем предварительно инкубированы в течение 1 часа при 37 ° C с 1,5 нг рекомбинантного RBD SARS-CoV-2 с шипом Уханьского штамма (Trenzyme), Вариант B.1.1.7 (N501Y; Alpha), вариант B.1.351 (K417N, E484K, N501Y; Beta) или вариант P.1 (K417T, E484K, N501Y; Gamma) (последние три от SinoBiological), все с C-концевым His-тегом. BD OptEIA Assay Diluent использовался для приготовления образца плазмы, а также для разбавлений RBD.После предварительной инкубации с RBD SARS-CoV-2 образцы плазмы помещали на покрытые hACE2 планшеты Maxisorp для ELISA в течение 1 часа при 37 ° C. Спайковые RBD SARS-CoV-2, предварительно инкубированные с буфером, служили только отрицательными контролями для ингибирования. Планшеты трижды промывали PBST и инкубировали с антителом против His-tag, конъюгированным с пероксидазой хрена (HRP) (клон HIS 3D5, предоставленный Helmholtz Zentrum München), в течение 1 часа при 37 ° C. Несвязавшееся антитело удаляли шестью промывками PBST. Колориметрический сигнал был получен при ферментативной реакции HRP с хромогенным субстратом 3,3 ‘, 5,5’-тетраметилбензидином (набор реагентов BD OptEIA TMB Substrate Reagent Set).Для остановки реакции добавляли равный объем 0,2 М H 2 SO 4 , и измеряли оптическую плотность при 450 нм и 570 нм с помощью считывающего устройства для микропланшетов SpectraMax iD3 (Molecular Devices) с использованием программного обеспечения SoftMax Pro версии 7.03. Для каждой лунки процент ингибирования рассчитывали из значений OD после вычитания фоновых значений как: Ингибирование (%) = (1 — значение OD образца / Среднее значение OD SARS-CoV-2 S RBD) × 100. Определяли нейтрализующие титры sVNT как разведение со снижением связывания> среднее + 2 с.d. значений из пула плазмы, состоящего из трех проб плазмы до пандемии.

Пулы белковых пептидов SARS-CoV-2

Мы заказали 15 пулов пептидов длиной (аа) и 10 перекрывающихся аминокислотных остатков, охватывающих всю длину SARS-CoV2-Spike (-S) (всего 253 пептида), — Мембрана (-M) (всего 43 пептида), -Нуклеокапсид (-N) (всего 82 пептида) или -Envelope (-E) (всего 12 пептидов; пептид № 4 не может быть синтезирован) от GenScript. Все лиофилизированные пептиды были синтезированы с чистотой более 95% и восстановлены при исходной концентрации 50 мг / мл -1 в ДМСО (Sigma-Aldrich), за исключением девяти перекрывающихся пептидов SARS-CoV2-S (№№.24, 190, 191, 225, 226, 234, 244, 245 и 246), два для SARS-CoV2-M (№ 15 и 16), один для SARS-CoV2-N (№ 61) и все 12 SARS -CoV2-E пептиды, которые были растворены в 25 мг / мл -1 из-за проблем с растворимостью. Все пептиды в исходных количествах ДМСО хранили при -80 ° C до использования.

Анализ повторной стимуляции Т-клеток

PBMC, выделенных с использованием градиента фиколла, ресуспендировали при концентрации 20 × 10 6 клеток на мл в полной среде RPMI (RPMI 1640 (Gibco)) с добавлением 10% FBS ( GE Healthcare Life Sciences), 1 мМ пирувата натрия, 50 мкМ β-меркаптоэтанола и 1% стрептомицин-пенициллин (все Gibco).Для стимуляции клетки разбавляли равными объемами пептидных пулов, содержащих S-белок или смесь M-, N- и E-белков. Пулы пептидов готовили в полной RPMI, содержащей брефельдин А (Sigma-Aldrich) в конечной концентрации 10 мкг / мл -1 . В конечной смеси каждый пептид имел концентрацию 2 мкг (~ 1,2 нмоль) мл -1 , за исключением пептидов SARS-CoV2-S 24, 190, 191, 225, 226, 234, 244, 245 и 246, Пептиды SARS-CoV2-M 15 и 16 и пептид SARS-CoV2-N 61, которые использовали в конечной концентрации 1 мкг / мл -1 из-за проблем с растворимостью.В качестве отрицательного контроля мы стимулировали клетки ДМСО в максимальном объеме, соответствующем количеству ДМСО в пептидных пулах (равному 5% ДМСО в конечном объеме среды). В каждом эксперименте мы использовали клетки, стимулированные форбол-12-миристат-13-ацетатом (Calbiochem) и иономицином (Invitrogen) в конечной концентрации 50 нг мл -1 и 1500 нг мл -1 , соответственно, как внутренний положительный контроль. Затем клетки инкубировали в течение 12–16 ч при 37 ° C, 5% CO 2 . После промывания клетки ресуспендировали в буфере MACS (PBS с добавлением 3% FBS и 2 мМ EDTA).Неспецифическое связывание антител блокировали инкубацией образцов с 10% сывороткой мыши при 4 ° C в течение 15 мин. Затем, без промывания, смесь антител анти-CD3-AF532 (UCHT1; № 58-0038-42, номер партии 2288218; Invitrogen; 1:50), анти-CD4-BUV563 (RPA-T4; № 741353). , лот № 9333607; BD Biosciences; 1: 200), анти-CD8-SparkBlue 550 (SK1; № 344760, лот № B326454; BioLegend; 1: 200), анти-CD45RA (HI100; № 740298, лот № 0295003; BD Biosciences; 1: 200), анти-CCR7 (G043H7; № 353230, лот № B335328; BioLegend; 1:50), анти-CD38 PerCP-eF710 (HB7; №46-0388-42, лот № 2044748; Invitrogen; 1: 100) и был добавлен комплект Zombie NIR Fixable Viability Kit (№ 423106, лот № B323372; BioLegend). После окрашивания в течение 20 минут при комнатной температуре клетки промывали перед фиксацией и повышением проницаемости (№ 554714, BD Biosciences) в соответствии с протоколом производителя. Затем внутриклеточные цитокины окрашивали с использованием анти-IFN-PE-Cy7 (B27; № 506518, лот № B326674; BioLegend; 1: 100), анти-TNF-AF700 (Mab11; № 502928, № партии B326186; BioLegend; 1:50) и анти-IL-17A-BV421 (BL168; нет.512322, лот № B317903; BioLegend; 1:50) в течение 45 мин при комнатной температуре. Избыточные антитела смывали, а затем клетки собирали на спектральном проточном цитометре Cytek Aurora (Cytek), оборудованном пятью лазерами, работающими при 355 нм, 405 нм, 488 нм, 561 нм и 640 нм. Все данные проточной цитометрии были получены с использованием SpectroFlo версии 2.2.0 (Cytek) и проанализированы с помощью FCS Express 7 (Denovo).

Проточно-цитометрический анализ спайк-специфических В-клеток

Общие лейкоциты выделяли из цельной крови с помощью эритролиза в 0.83% раствор хлорида аммония. Затем выделенные клетки промывали, подсчитывали и ресуспендировали в PBS и окрашивали в течение 20 минут при комнатной температуре смесью антител, содержащей антитела, перечисленные на рис. 4 расширенных данных, вместе с белком spike-mNEONGreen (5 мкг на реакцию; получение будет описано в другом месте). . После одной промывки образцы собирали на спектральном проточном цитометре, и данные анализировали, как описано выше.

Количественная оценка высвобождения IFN-γ и TNF-α

Далее, 0.5 мл полной крови стимулировали выбранными производителем частями домена SARS-CoV-2 S1 спайкового белка в течение 20-24 часов. Мы провели отрицательный и положительный контроли в соответствии с инструкциями производителя (анализ выделения гамма-интерферона SARS-CoV-2 (Euroimmun)). После стимуляции супернатанты собирали после центрифугирования и исследовали с помощью набора LEGENDplex (BioLegend) в соответствии с инструкциями производителя. Данные дублированных измерений были получены с помощью проточного цитометра LSR II (BD Biosciences) с использованием BD FACSDiva версии 8.0.1 и проанализированы с помощью программного обеспечения LEGENDplex Data Analysis Software Suite, Gen5 версии 2.01.

Статистика

Статистический анализ был выполнен с использованием GraphPad Prism версии 8.4 (программное обеспечение GraphPad Software) и SPSS версии 20.0.0 (IBM, SPSS Statistics). Для сравнения спайк-специфичных уровней IgG и IgA, а также для сравнения процентного содержания цитокин-секретирующих Т-клеток или концентраций цитокинов в сыворотке мы использовали парный t -тест (внутри групп) или двухфакторный дисперсионный анализ.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *